細胞在體外進行培養(yǎng)時影響生長的幾點因素
細胞在體外進行培養(yǎng),失去了機體的調(diào)節(jié)和控制,因此,除滿足營養(yǎng)的要求外,還必須使細胞生存環(huán)境晝接近活體的環(huán)境.外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、酸堿度等均能影響細胞的生長.
一、溫度：
一般哺乳類及禽類細胞體外培養(yǎng)的適宜溫度是37~38℃.溫度過高或過低都會影響到細胞的生長.細胞耐受低溫的能力比抗熱的能力強,在低溫下,細胞的代謝活力及核分裂降低.溫度低于0℃時,雖影響細胞代謝,但并無傷害作用.把細胞置于23~25℃時,細胞仍能生存和生長,但速度減緩,不過,魚類細胞的適宜培養(yǎng)溫度為23~25℃.若溫度過低,在降到冰點以下時,細胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡,但若向培養(yǎng)基中加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）等保護劑,封入安瓿中后,置于液氮或低溫冰箱（-70℃）中,可起保護作用,此時細胞可而耐受-70℃以下溫度,能長期儲存,解凍后細胞復(fù)蘇,仍能繼續(xù)生長增殖,細胞物性狀不受任何影響.此為保存細胞的主要手段.
高溫對細胞培養(yǎng)不利.細胞在39~40℃培養(yǎng)1h,會受到一定損傷,但仍有可能恢復(fù),但不能忍受溫度再升高2℃,持續(xù)數(shù)小時,即在41~42℃培養(yǎng)1h,細胞操作嚴(yán)重,溫度到43℃以上時細胞多數(shù)被殺死.高溫主要引起酶的滅活、類脂質(zhì)破壞、核分裂的破壞,產(chǎn)生凝固酶使細胞發(fā)生凝固,另外使蛋白質(zhì)變性.因此,體外培養(yǎng)細胞時一定要避免高溫.
二、滲透壓：
細胞在高滲透溶液中低滲溶液中,可以立即發(fā)生皺縮或腫脹、破裂.所以,滲透壓是體外細胞培養(yǎng)的重要條件之一.哺乳動物和其他動物組織細胞體外孫女培養(yǎng)的滲透壓的維持主要與NaCl有關(guān),但不能忽視其他電解質(zhì)與滲透壓的關(guān)系,滲透壓與單位體積溶劑內(nèi)溶質(zhì)的分子數(shù)和離子婁成正比.為此,按一定比例控制培養(yǎng)基中離子平衡,維持正常滲透壓是很重要的.這不僅是為了維持細胞張力,而且是為了調(diào)節(jié)細胞的代謝.因為細胞外離子輸送和離子濃度改變著其他營養(yǎng)物質(zhì)的輸送（如氨基酸、糖等）,直接影響細胞基本合成系統(tǒng).
理想的滲透壓因細胞的類型及種族而異,人血漿滲透壓為290mmol/L,被視為是體外培養(yǎng)人類細胞的理想滲透壓.哺乳動物細胞的滲透壓一般為290~300mmol/L.人胚肺成纖維細胞為250~325mmol/L,鼠細胞則為310mmol/L左右.在實際應(yīng)用中,260~320mmol/L的滲透壓可適于大多數(shù)細胞.常用培養(yǎng)基的滲透壓值見表2-3.
三、氣體環(huán)境和PH值：
體外培植細胞需要理想的氣體環(huán)境,氧和二氧化碳石細胞生存必需的條件之一.
1、氧：
氧參加細胞的三羧酸循環(huán),產(chǎn)生能量以供應(yīng)給細胞生長、增殖和合成各種所需成分.有些細胞在低氧條件下,可借糖酵解取得能量,單多數(shù)細胞低氧時不能生存.氧張力通常維持在略低于大氣狀態(tài),若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細胞有害.
2、二氧化碳：
采用開放式培養(yǎng)時（碟或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)）,一般要把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環(huán)境中.CO2既是細胞的代謝產(chǎn)物,又是細胞生長所必需的成分,并與維持培養(yǎng)基的pH值有關(guān).在密閉瓶中CO2濃度偏低的情況下,細胞容易生長,一般不能低于1%,否則有損細胞.CO2增加將使pH值下降.
3、pH值：
大多數(shù)細胞適于在pH7.2~7.4條件下生長,低于pH6.8或高于pH7.6對細胞有害,甚至退變或死亡各種細胞對pH值的要求不盡相同.一般原代培養(yǎng)細胞對pH值的堿性的耐受比對酸性的耐受差,偏酸的環(huán)境比偏堿的環(huán)境對細胞生長有利.為了維持培養(yǎng)環(huán)境恒定的pH值,多采用在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑的方法.磷酸緩沖劑中的NaHCO3可供給CO2,但CO2易于逸出,故只適用于封閉式培養(yǎng).若開放式培養(yǎng)還是置于含有5%CO2的氣體環(huán)境中為宜.為克服NaHCO3調(diào)整的麻煩,也可用羧基哌唪硫磺酸（N-2 –hydroxyethyl piperazine-N’ethanesulfonic acid,Hepes）,它對細胞無毒性,主要作用是防止pH值迅速變動,在開瓶通氣培養(yǎng)或活細胞觀察時能維持較恒定的pH值.
四、無毒和無菌：
無毒和無菌是體外培養(yǎng)細胞的首要環(huán)境條件.細胞在深入活體內(nèi),偶爾有**或有害物質(zhì)入侵,因體內(nèi)有強大的**系統(tǒng)和**系統(tǒng),可將其**或**,而不易受損害.但在離體的環(huán)境中,失去了防御系統(tǒng),一旦有害物質(zhì)入侵或**污染,可導(dǎo)致細胞死亡,前功盡棄.如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、支持物、培養(yǎng)基、瓶塞上有細胞毒性,在培養(yǎng)過程中可導(dǎo)致細胞死亡因此,在選用這些器皿、材料時要注意,若這些物品**不*,帶菌或操作過程不小心使細胞污染,也會導(dǎo)致細胞死亡.若出現(xiàn)交叉污染,可使實驗室原來的細胞系失去原有特性,應(yīng)引起足夠的重視.
五、輻射線和超聲波：
1、可見光
可見光的波長是390~780nm.可見光的各種有色光能引起細胞退變,延長核分裂的間期,還可顯著降低細胞的附壁能力.因此,體外培養(yǎng)細胞應(yīng)避免日光直接照射,*好在黑暗中進行培養(yǎng)或短期存放.
2、紫外線
弱紫外線下耐受能力強的細胞變化不大,但對敏感的細胞有損害.紫外線強時,就分離的細胞顯示：不能進行*的有絲分裂；在有絲分裂時增加了脫水收縮；在有絲分裂時細胞質(zhì)的起泡減少.Elrlich腹水癌細胞經(jīng)紫外線照射后,用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)被照射表面形成水泡,隨后細胞膨脹,損害也漸變嚴(yán)重.
3、放射線
X射線對細胞有明顯損傷.B射線可影響細胞核的分裂.R射線使核分裂數(shù)減少并出現(xiàn)不正常的核分裂,可使細胞死亡.
4、超聲波
在超聲波振動下,細胞很快會破裂,開始是胞質(zhì)發(fā)生紊亂的流動,原生質(zhì)膠體結(jié)構(gòu)也有明顯變化,若停止超聲波振動可恢復(fù).細胞致死的原因是由于產(chǎn)生空化作用所致.當(dāng)超聲波在2.5W/c㎡時,細胞受損,染色體發(fā)生畸變,首先發(fā)生畸變的是核染色體.
六、細胞接種密度：
在體外培養(yǎng)細胞中,細胞接種數(shù)對細胞的生長有影響,適宜的接種密度,可以促使細胞增殖,接種密度太低或太高都不利于細胞的生長增殖.如果培養(yǎng)基與細胞的容積比例大于2000：1,生長物質(zhì)彌散到細胞外過多,將使細胞內(nèi)濃度低于*小限度的濃度,此時細胞不能再增殖,培養(yǎng)基的pH值變堿,抑制細胞生長,細胞變圓不能貼壁,甚至引起細胞死亡等.如果接種密度太高,每個細胞周圍培養(yǎng)基的容積降至0.007㎜3以下,由于彌散率降低,細胞內(nèi)生物質(zhì)的濃度增加,容易使排出物或其他代謝產(chǎn)物達到飽和,能量來源也很快耗盡,因此也會防礙細胞的增殖.
如何選擇適宜的接種濃度要根據(jù)細胞的代謝和生長繁殖速度以及工作的需要而確定.一般來說,代謝旺盛、生長速度快的細胞（如腫瘤細胞）,接種濃度宜偏低；而正常組織細胞生長較慢,代謝不夠旺盛,接種濃度可偏高；如果是為了保種或不需急用,接種可偏低些；有時為了便于觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu),接種濃度也可適當(dāng)降低.
七、容器轉(zhuǎn)動速度和懸浮攪動速度：
有時為了研究的需要而將培養(yǎng)細胞在容器中進行旋轉(zhuǎn)或攪動,如貼壁細胞在旋轉(zhuǎn)管中培養(yǎng),使轉(zhuǎn)鼓的轉(zhuǎn)速提高,細胞增殖率隨之提高.其原因可能是轉(zhuǎn)動使足夠的營養(yǎng)物質(zhì)流動和較充分的氧化作用之故.
當(dāng)懸浮攪拌培養(yǎng)細胞時,攪拌速度既不能太快,也不能太慢.如果太慢,細胞易結(jié)團、下沉和貼壁,不利于細胞在懸浮狀態(tài)下增殖.如果太快,容易起泡沫,細胞易窒息致死,同時,強烈地攪動易使細胞因機械損傷而破裂.所以選擇適宜的攪拌速度很重要.如BHK-21細胞的攪拌適宜速度為460～330r/min；**細胞（Raji細胞）株,在200r/min和400r/min（Namalva細胞）生長速度快,在80～1000r/min時既不結(jié)團,又不需要加抗泡沫劑,細胞生長仍然很快.各種細胞的適宜攪拌速度不一致,通常與細胞的特性和質(zhì)量有關(guān),應(yīng)予以注意.
